Культивирование эмбрионов

Культуральная система СООК – это группа продуктов, изготовленных для получения лучших результатов в лечении бесплодия при помощи новейших технологий и строгих стандартов производства.

Нет никаких необъяснимых факторов для улучшения результатов и достижения успеха – только внимательность к каждому шагу и каждой процедуре, и в этом случае наилучший результат будет достигнут.

Свойства сред

Система культуральных сред была впервые разработана в Sydney IVF (SIVF), но эта система универсальна и открыта для изменений и индивидуальных модификаций. Для процедур культивирования необходима бикарбонатная среда, состав которой позволяет поддерживать pH 7.30–7.35 в атмосфере с содержанием 6% CO2 при 37°C. Среда с HEPES, в качестве буфера, поддерживает pH of 7.3–7.5 на воздухе при 37°C.

Для всех процедур среды, за исключением Буфера для промывания фолликулов, содержат человеческий сывороточный альбумин (до 20 мг/мл), и гентамицин (до 0.01 мг/мл). Человеческий сывороточный альбумин, используемый в средах, фармакологически очищен и разрешен для использования для внутривенных инфузий.

Все среды стерилизованы фильтрацией для достижения уровня стерильности (sterility assurance level, SAL), равного 10-3. Результаты теста на мышиных эмбрионах (MEA), тестирования жизнеспособности сперматозоидов (HSSA) и теста на эндотоксины (LAL) подтверждены несколькими Сертификатами качества, которые доступны по запросу.

Противопоказания

Поскольку среды Cook содержат гентамицин, нужно избегать их использования у пациентов с аллергией на гентамицин.

Типы сред

Список различных типов сред и соответствующих буферных растворов приведен в таблице 1, указывающей их соответствие. Все культуральные среды содержат одни базовые солевые концентрации для снижения стресса при смене сред.

Хранение и использование

Среды поставляются во флаконах из боросиликатного стекла Типа 1, которые специально очищены от пирогенов перед заполнением растворами. Пробка из сверхчистого материала используется вместе с алюминиевым колпачком, что гарантирует целостность флакона и продляет время жизни сред.

Использование сред

До начала использования сред полезно начертить схему всех этапов, чтобы получить ясность, какие процедуры требуют использования бикарбонатных сред или буферов на основе HEPES. Стандартная схема изображена на рис. 3.

Таблица 1

Способ работы

• Все среды должны храниться при 2–8°C.
• Должна использоваться асептическая техника, поэтому все открытые флаконы должны находиться в ламинарном шкафу в потоке воздуха.
• Снимите пластиковый колпачок и осторожно отогните и потяните металлическое кольцо, пока не порвется алюминиевая оболочка. Снимите остатки оболочки.
• Используя стерильные перчатки без талька, снимите резиновую пробку, осторожно покачивая края крышки. Важно не касаться внутренней поверхности крышки.
• Стерильность крышки можно сохранить, кладя ее «лицом» вниз на стерильную чашку Петри во время отбора аликвоты из флакона.
• Отбирайте аликвоты среды с помощью одноразовых стерильных пипеток. Рекомендовано использование настольного СО2-инкубатора K-MINC-1000. Этот инкубатор экономичен в расходе газа и быстро восстанавливает температуру, влажность и pH.
• Аккуратно снимайте крышку, чтобы не контаминировать внутреннюю поверхность крышки и кромку флакона. В случае, если есть подозрение на контаминацию, избавьтесь от флакона.
• В качестве альтернативы среда может быть отобрана из флакона с помощью стерильной пункционной иглы и нетоксичного шприца. Крышка может быть стерилизована 70% раствором этанола. Работайте с флаконом быстро, чтобы избежать выпадения осадка при испарении.
• Не стерилизуйте растворы повторно.
• Рекомендована утилизация пустых флаконов в контейнерах для опасного мусора.

НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ ПРОДУКТЫ В СЛУЧАЕ

• Поврежденной упаковки.
• Утерянного колпачка крышки.
• Мутного раствора во флаконе.

Условия инкубирования и требования к газовой среде

Ключевые моменты

• Культивирование в средах только тогда будет иметь успех, когда будут соблюдены точные стабильные условия pH и температуры. Среды на основе бикарбонатного буфера приготовлены для получения оптимального результата при условии работы в газовой среде: 6% CO2, 5% O2, 89% N2. Использование 6% CO2 снижает время, необходимое для восстановления неуравновешенной (неоткалиброванной) среды и достижения правильного pH (см. рис. 1). Это снижает стрессовое воздействие на эмбрион, которому сложно восстановить внутриклеточный гомеостаз при колебаниях окружающей среды. Культивирование может проходить в смеси воздуха и 6% СО2. Среды содержат антиоксиданты для снижения оксидантного стресса.
• Использование 5% O2 рекомендуется для культивирования бластоцист.
• Количество открывания двери CO2 инкубатора должны минимизированы.

Концентрация 6% CO2 используется для культивирования, если лаборатория ЭКО находится на уровне моря, если же лаборатория размещена выше уровня моря, концентрация СО2 должна быть равна в соответствии с уравнением Гендерсона-Хассельбаха:

pH = pKa + log10 ([HCO3-] / [CO2]) (см. рис. 2).

Рис.1

Рис.2

Рекомендуется использование CO2-инкубатора СООК, он экономичен в расходовании газа и быстро восстанавливает температуру, влажность и pH.

Уравновешивание сред и подготовка к работе

Все процедуры со средами и подготовка культуральной посуды должны проходить в асептических условиях. 

Ключевые моменты

• Чашки и пробирки, содержащие необходимые объемы среды, должны быть подготовлены за день до использования для уравновешивания сред в CO2-aтмосфере.
• Как минимум 6 часов необходимо для уравновешивания сред и культурального масла.
• Чашки сначала должны быть промаркированы, затем с помощью стерильной пипетки добавляются среда и масло.
• Среда может быть приготовлена в многолуночном планшете в микрокаплях.
• Не инкубируйте HEPES-буферы в CO2-атмосфере.

Процедуры с гаметами и эмбрионами

Прежде чем выполнять какую-либо процедуру, убедитесь, что все растворы предварительно нагреты и уравновешены. Некоторые лаборатории работают в специальных камерах с регулируемой температурой и влажностью, но если этих условий нет, используйте столики микроскопа с нагревом и ламинарный шкаф с подогревом стола. Неважно, используется ли работа под маслом или культивирование проходит без масла, старайтесь как можно меньше держать гаметы и эмбрионы вне инкубатора.

Помните, что внешние агенты, такие, как спирты или летучие карбоновые кислоты, могут попадать в растворы из воздуха. Рекомендовано использование угольного фильтра для очистки поступающего газа.

Контроль температуры и pH

Хорошо известно, что быстрые колебания температуры и pH могут быть вредны для ооцита и эмбриона и часто приводят к фрагментации. Снижение стресса для ооцитов может быть достигнуто устранением температурных колебаний с помощью нагревателя пробирок (K-FTH-1012), поддержания постоянных условий и температуры в лаборатории в интервале 25–30°C, использование нагревательных столиков и инкубатора (K-MINC-1000) с быстрым временем восстановления параметров.

Может быть использовано дополнительное увлажнение воздуха комнат. Температура Буфера для промывания фолликулов (K-SIFB) должна точно поддерживаться немного выше 37°C с учетом охлаждения при процедуре промывки фолликулов.

CO2-дегазация бикарбонатных сред (т.e. pH сдвиг) присутствует во всех типах культуральной посуды и объемах сред, в любой лаборатории. pH-сдвиг по причине дегазации зависит от площади поверхности и объема среды. Регазация для уравновешивания занимает много времени. Регазация и достижение допустимых значений pH требуют больше времени, чем дегазация и изменение pH. Слой культурального масла может изменить скорость дегазации, и что более важно – насыщения газом среды. Снижение времени нахождения чашек вне инкубатора должно быть правилом при работе с культурой.