Оплодотворение
Группа сред для оплодотворения предназначена для достижения стадии зиготы в эмбриональном развитии.
ОПЛОДОТВОРЕНИЕ
Группа сред для оплодотворения предназначена для достижения стадии зиготы в эмбриональном развитии.
Номера по каталогу:
Среда оплодотворения K-SIFM-20, K-SIFM-50, K-SIFM-100
Среда оплодотворения на основе бикарбонатного буфера предназначена для создания оптимальной среды для взаимодействия сперматозоида и ооцита при оплодотворении in vitro.
Культуральное масло K-SICO-50, K-SICO-200
Культуральное масло используется для наслоения поверх среды для снижения осмотического стресса вследствие испарения и для уменьшения колебаний pH.
Гиалуронидаза K-SIHY-1-5
Гиалуронидаза, фермент в растворе на основе бикарбонатного буфера, предназначен для удаления кумулюсных клеток, окружающих ооцит перед процедурой ИКСИ.
PVP K-SIPV-200-5
10% поливинилпироллидон в бикарбонатном буфере. PVP используется для снижения подвижности сперматозоидов, более удобного взятия сперматозоида микроинъекционной пипеткой для ИКСИ и контролируемой инъекции в ооцит. Среда оплодотворения на основе бикарбонатного буфера предназначена для создания оптимальной среды для взаимодействия сперматозоида и ооцита при оплодотворении in vitro.
Культивирование ооцита и оплодотворение in vitro
Оплодотворение ооцита
Оплодотворение обычно проводится после 38–40 часов после стимуляции hCG, т.е. 3–4 часа после сбора ооцитов. Оптимальная концентрация сперматозоидов приблизительно
равна 80.000–100.000 подвижных сперматозоидов на 1 мл, если не вовлечен мужской фактор бесплодия.
Продолжительность оплодотворения.
- Стандартное время оплодотворения in vitro – 16–18 часов для инкубации сперматозоидов с ооцитами, это необходимый минимум для лабораторий на протяжении многих лет. Недавние исследования показывают, что продукция активных форм кислорода, продуцирующихся при гибели сперматозоидов, могут нанести вред ооциту и дальнейшему развитию эмбриона.
- Оплодотворение в течение одного часа, как было показано, не ухудшает эффективность оплодотворения.
- Поэтому продолжительность оплодотворения должна быть подобрана индивидуально для каждой лаборатории в зависимости от процедуры и может варьироваться в зависимости от качества спермы.
Методика
В идеале процедура должна проводиться в камере с контролируемыми условиями среды, но если это невозможно, можно использовать столик с подогревом диссекционного микроскопа.
1. Концентрация сперматозоидов должна быть точно вычислена и находиться в пределах 8–10 x 106 подвижных сперматозоидов на 1 мл, в как можно малом объеме среды для добавления в чашку для оплодотворения, чтобы минимизировать изменения общего объема среды.
2. Объем переносимого образца сперматозоидов должен быть рассчитан так, чтобы конечная концентрация в общем объеме лунки была в пределах 80–100 000/мл.
3. Добавьте сперматозоиды в каждую лунку и поместите чашку на темное поле диссекционного микроскопа, чтобы убедиться, что присутствуют подвижные сперматозоиды.
4. Поставьте чашку в инкубатор до того, как пройдет время для оплодотворения (16–18 часов) или пройдет короткое время для оплодотворения (минимум 2 часа).
5. Если используется короткое время инкубации, ОКК должны быть слегка диссоциированы от кумулюсных клеток пипетированием (см. раздел ниже).
6. Затем ооциты помещаются в новую чашку Петри со свежей уравновешенной Средой оплодотворения (K-SIFM) и помещаются в инкубатор.
Короткий метод оплодотворения in vitro
Подготовка планшета для короткой процедуры.
Эта рекомендация для короткого время инкубации.
1. Добавьте 0.7 мл Среды оплодотворения в каждую лунку первого планшета Nunc®, маркированного «пункция», и наслоите поверх среды 0.3 мл Культурального масла (K-SICO).
2. Добавьте в первую лунку второго планшета 0.7 мл Среды оплодотворения и наслоите 0,3 мл Культурального масла, промаркируйте первую лунку «пункция-2».
3. В каждую из второй, третьей и четвертой лунок добавьте по 30 мкл Среды оплодотворения и наслоите поверх 0.6 мл уравновешенного Культурального масла. Промаркируйте эти лунки второго планшета – «отмывка».
4. Инкубируйте в течение ночи в CO2-инкубаторе.
Если используется короткая процедура и инкубация проходит в течение двух часов перед извлечением ооцитов из культуры, их нужно поместить в свежую среду.
1. Добавьте к ооцитам рассчитанный объем отмытых сперматозоидов с помощью пипетки на 20–200 мкл и стерильного наконечника, чтобы в лунке было рассчитанное количество подвижных сперматозоидов.
2. Используя Пастеровскую пипетку (или 20–200 мкл пипетку), аккуратно перемешайте сперматозоиды и среду, содержащую ооциты, т.к. сплошная поверхность кумулюсных масс мешает оплодотворению.
3. После двух часов инкубации сперматозоиды «разрушают» кумулюсные массы. Эти клетки отбираются с помощью 300 мкм FlexipetTM. Удаляйте только те массы, которые удалить легко, не делайте полную денудацию ооцита.
4. Ооциты из первой и второй лунок первого планшета слегка отмываются в первой лунке второго планшета и помещаются в 30 мкл каплю во вторую (и третью) лунку.
5. Ооциты из третьей и четвертой лунок первого планшета слегка отмываются в первой лунке второго планшета и помещаются в 30 мкл капли в третью (и четвертую) лунку.
6. Запишите данные для идентификации ооцитов, промаркируйте и верните в инкубатор MINC в нужные позиции.
7. Верните планшеты Nunc в инкубатор MINC и остатки сперматозоидов в CO2-инкубатор.
8. Запишите данные в карту пациента и установите таймер на два часа.
9. Затем ооциты помещаются в новую чашку, содержащую Среду для оплодотворения и затем в инкубатор.
Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида
Введение
В настоящее время ИКСИ составляет до 50% всех процедур искусственного оплодотворения. Несмотря на большое количество протоколов, они разделяются на два типа манипуляций: в HEPES-буфере и бикарбонатном буфере.
Среды Cook SIVF подходят для использования любого из этих типов манипуляций.
• Если оператор, проводящий ИКСИ, опытен и может проводить манипуляции в микрокаплях Среды дробления (K-SICM) под маслом, он имеет в распоряжении 5–10 мин. для проведения инъекции до начала изменения pH в среде.
• Если оператор нуждается в большем времени, может быть использован Универсальный буфер для гамет на основе HEPES (K-SIGB), но оператор не должен работать с каждой чашкой дольше 20 мин.
• Температурные колебания должны быть минимизированы. Также надо отметить, что при работе с буфером HEPES попадает внутрь ооцита.
Удаление кумулюса гиалуронидазой
• Гиалуронидаза используется для удаления кумулюсных клеток, окружающих ооцит, чтобы визуализировать полярное тельце и правильно расположить ооцит перед инъекцией сперматозоида.
• Гиалуронидаза (K-SIHY-1-5) – это Среда оплодотворения, содержащая 80 IU гиалуронидазы. Поскольку это среда на основе бикарбонатного буфера, то она нуждается в предварительном уравновешивании в 6% CO2-среде перед использованием. Важно работать с Культуральным маслом для снижения сдвига pH вследствие дегазации среды.
• Фермент помещается в одну лунку четырехлуночного планшета (или подобной посуды), другие три лунки содержат аликвоты Среды дробления (K-SICM) или Универсального буфера для гамет. Они используются для отмывки ооцитов после обработки гиалуронидазой.
• Подготовьте все заранее. Приготовьте все пипетки FlexipetTM для денудации ооцита чтобы ооциты не находились вне инкубатора продолжительное время.
Ключевые моменты
• Гиалуронидаза используется в концентрации 80 IU/мл.
• Ооцит-кумулюсные комплексы должны находиться в гиалуронидазе НЕ БОЛЕЕ одной минуты!
• Избегайте чрезмерного пипетирования или грубой работы с ооцитами во время денудации. Помните, что ооциты достаточно нежные и склонны к лизису, если аспирируются слишком энергично.
• Обычно ооциты денудируются через час или два после аспирации и ИКСИ производится после часа-двух после удаления кумулюсных клеток.
Методика
1. Уравновесьте pH и температуру среды при 37°C в 6% CO2 в инкубаторе в течение ночи.
2. Используя необходимого размера FlexipetTM, поместите 1–5 ОКК в гиалуронидазу и пипетируйте их какое-то время до тех пор, пока не удалятся кумулюсные клетки. Избегайте образования пузырей!
3. Перенесите частично денудированные ооциты в лунку со свежей Средой дробления (K-SICM) или Универсального буфера для гамет (K-SIGB), если используется буферная система на основе HEPES.
4. Используя FlexipetTM со все меньшим диаметром, продолжайте удалять клетки короны, пока зона не станет свободной от клеток. FlexipetTM Сook наиболее подходят для этого, т.к. они сделаны из неломкого поликарбоната и не могут повредить ооцит. Пипетки FlexipetTM доступны в 170, 140, 130 и 120 мкм размерах внутреннего диаметра.
5. Использование FlexipetTM
a. Выберите правильный диаметр, подходящий для работы с ооцитом.
b. Перед работой промойте кончик пипетки FlexipetTM. Удостоверьтесь, что внутренняя поверхность увлажнена, опуская поршень до первого упора.
c. Опустите кончик в среду и медленно отпустите поршень рукоятки.
d. Удалите среду, нажимая поршень до второго упора, пока среда не будет вытолкнута из наконечника. Во избежание появления пузырей не нажимайте поршень до упора, оставляйте минимальный объем в кончике, остаток среды удалите касанием стенки чашки.
e. Полностью промойте наконечник FlexipetTM в среду, как описано, для увлажнения внутреннего просвета перед аспирацией ооцита или эмбриона.
6. Поместите кончик FlexipetTM так близко к ооциту, как возможно, и аккуратно пипетируйте ооцит. Для фиксирования наконечника и снижения его колебаний прислоните запястье к краю столика микроскопа или крышке инкубатора. Если ооцит прилипает к стенке наконечника, наконечник можно снять и промыть с проксимального конца объемом среды с помощью Набора для промывания Флексипет (K-FFS-2000).
7. Как только ооцит будет очищен, его следует промыть в нескольких лунках.
8. Повторите процедуру для каждого ооцита.
9. Оцените ооциты по степени развития и нахождению на стадии метафазы. Микроинъекция должна проводиться только с ооцитами:
a. С интактной zona pellucida.
b. С четко видимым первым полярным тельцем в перивителлиновом пространстве (метафаза II).
c. С клетками преимущественно без вакуолей или других аномалий в цитоплазме.
10. Поместите очищенный ооцит в Среду дробления и затем в CO2-инкубатор.
Подготовка чашек
Чашка для инъекции должна быть с подготовленной уравновешенной Средой дробления (K-SICM). Если процедура занимает больше 10 мин., должен быть использован Универсальный буфер для гамет (K-SIGB), нагретый перед использованием до 37°C.
PVP помещается в центральную каплю в чашке, а сперматозоиды помещаются сбоку в этой капле. Наслоите на центральные капли Культуральное масло (K-SICO) и если необходимо
уравновесьте все растворы в чашке. Поместите ооциты в периферические капли.
Так же можно развести подготовленные образцы сперматозоидов, напрямую смешивая их с PVP (K-SIPV-5-200) и помещая в центр чашки. Это может выполняться для всех образцов спермы, за исключением PESA/TESA/образцов с азооспермией.
Методика
- Установите ИКСИ-инструменты.
- Поместите один ооцит в каждую манипуляционную каплю.
- Перебейте хвост сперматозоида инъекционной микропипеткой. Важно не повредить район хвоста сперматозоида, поскольку он содержит центриоль, необходимую для последующего расхождения хромосом при клеточном делении. Неудачное повреждение хвоста сперматозоида снижает вероятность успеха оплодотворения ИКСИ.
- Столик микроскопа сдвигается для визуализации одной из капель среды. Затем ооцит фиксируется, присасываясь к холдинговой пипетке. Важно зафиксировать ооцит, чтобы полярное тельце находилось в позиции на 12 или на 6 часов. Позиция на 6 часов сейчас наиболее используема.
- Инъекционная микропипетка прокалывает zona pellucida и мембрану и проникает в цитоплазму в положении на 3 часа. Так как мембрана очень эластична, кончик микропипетки может достичь уровня zona pellucida напротив точки прокола без повреждения мембраны ооцита. Поэтому нужно аспирировать часть цитоплазмы внутрь инъекционной микропипетки, чтобы удостовериться в наличии прокола, до инъекции сперматозоида.
- Когда мембрана проколота (игла внезапно проваливается в цитоплазму), сперматозоид доставляется вместе с аспирированной цитоплазмой в ооцит.
- После инъекции сперматозоида в как можно меньшем объеме PVP микропипетка аккуратно вынимается, затем подается давление к холдинговой пипетке, чтобы освободить ооцит.
- Повторите инъекцию для всех ооцитов в чашке.
- После инъекции ооциты должны быть отмыты и инкубированы в уравновешенной Среде дробления в течение 16–18 часов.
- Даже если столик микроскопа подогревается и среда находится под маслом, все равно происходят изменения среды в каплях. Если сперматозоиды сложно поймать микропипеткой и провести ИКСИ в течение короткого времени, чашки снова нужно поставить в инкубатор для уравновешивания с газовой средой.
Похожие новости:
