Дробление

Номера по каталогу:
Среда дробления  K-SICM-20, K-SICM-50, K-SICM-100

Среда дробления на основе бикарбонатного буфера предназначена для культивирования эмбриона на ранней стадии со стадии зиготы (1-й день) до 3-го дня развития.

 

Набор для криоконсервации эмбрионов  K-SICS-5000

Буфер на основе HEPES предназначен для криоконсервации эмбрионов на стадии развития 1–4-й день.

 

Набор для размораживания эмбрионов K-SITS-5000

Буфер на основе HEPES предназначен для размораживания эмбрионов.

 

Среда для биопсии бластомера  K-SIEB-20

Среда на основе бикарбонатного буфера без кальция и магния предназначена для биопсии бластомера у эмбриона на стадии развития 3-й день.

---

Оценка оплодотворения в 1-й день развития

Очищенные и денудированные оплодотворенные ооциты должны быть помещены в СО2-камеру в Среде дробления (K-SICM) или, если это невозможно, – в Универсальный буфер для гамет (K-SIGB) на воздухе при 37°C на диссекционном столике с подогревом.

Оценка оплодотворения – беглый взгляд для оценки ряда обычных и всех необычных и отличных от нормы морфологических параметров развития, которые могут быть замечены через некоторый промежуток времени.

 

Ключевые моменты

• Оплодотворенные in vitro ооциты должны быть проверены через 16–20 часов после процедуры. Ооциты, оплодотворенные ИКСИ, должны быть проверены спустя 14–18 часов после инъекции.
• Важно аккуратно отмыть зиготы для удаления возможных остатков Среды оплодотворения перед инкубацией в Среде дробления.
• Каждый раз старайтесь как можно реже держать среды вне инкубатора.

Методика

1. Используя Flexipet^TM, очистите все возможные остатки кумулюсных клеток, как описано в разделе о денудации. Для предотвращения попадания кумулюсных клеток и образования фибриновых сгустков перенесите зиготу в новую чашку со свежей средой.
2. Используя Flexipet^TM, передвигайте зиготу для всестороннего обзора под максимальным увелечением диссекционного микроскопа (~40x). Настройте подсветку для наибольшего контраста изображения.
3. Определите количество пронуклеусов, полярных телец и общую морфологию зиготы.
4. Принимайте во внимание только оплодотворенные ооциты, которые имеют два пронуклеуса.
5. Все зиготы с одним пронуклеусом должны быть возвращены в культуру и еще раз осмотрены через часовые интервалы.
6. Зиготы с тремя пронуклеусами классифицируются как многоядерные или с аномалией образования второго полярного тельца и должны быть удалены из культуры.
7. Посчитайте все зиготы и сгруппируйте их все вместе в объеме уравновешенной Среды дробления (K-SICM), удостоверьтесь, что они полностью отмыты в Среде дробления перед инкубацией.
8. Обычное отмывание зигот – это промывка первый раз в 2 мл Среды дробления и второй раз в 0.6 мл и последующее культивирование в 10 мкл микрокаплях под маслом.

Важно! Культура зигот/эмбрионов может проводиться в лунках без масла и в микрокаплях под маслом. Недостатками открытого культивирования в лунках являются большой расход среды, быстрые сдвиги температуры и pH в чашках, находящихся вне инкубатора. Температура и pH изменяются не так быстро, если культивирование идет под маслом, но недостатком масла является то, что его необходимо проверять на токсичность, промывать в средах и затем уравновешивать перед использованием. Минеральное масло (K-SICO) тщательно промыто средой и фильтровано для исключения токсичных агентов. Помните, что если масло препятствует дегазации среды, то оно также препятствует насыщению газом и уравновешиванию.

 

---

Оценка качества эмбриона на 2-й день
Примерно через 24 часа после предыдущей проверки оплодотворения (40–48 часов после оплодотворения) эмбрионы оцениваются снова перед переносом, криоконсервацией или последующим культивированием. Если необходимо, эмбрионы могут быть распределены на группы. Эмбрионы могут культивироваться в Среде дробления (K-SICM) приблизительно 60 часов. Их потребности в питательных веществах изменяются во время активации генома и во время компактизации эмбриона.

Среда дробления используется для культивирования эмбрионов, которые переносятся на 2-й и 3-й день. Если культивирование продолжается на 4-й и 5-й день, то эмбрионы должны быть перенесены в Среду для бластоцист (K-SIBM) в 3-й день.
Эмбрион, культивируемый до 5-го дня, должен быть тщательно отмыт от Среды дробления уравновешенной Средой для бластоцист. К 40–48 часам после оплодотворения эмбрион должен быть оценен перед переносом, криоконсервацией или последующим культивированием (до 3-го дня).

• Поместите чашку на нагревательный столик диссекционного микроскопа и проверьте 2 PN эмбрионы на степень их развития
• Используя Flexipet^TM, поворачивайте эмбрионы для всестороннего обзора под максимальным увеличением диссекционного микроскопа.
• Эмбрионы оцениваются по количеству бластомеров, правильной форме бластомеров, степени цитоплазматической фрагментации и степени дробления.
• Эмбрионы должны находиться на 4-клеточной стадии развития.
• Эмбрионы, отобранные для переноса, переносятся в новую чашку со свежей уравновешенной Средой дробления. Оставшиеся эмбрионы должны быть заморожены с помощью Набора для криоконсервации эмбрионов (K-SICS-5000) на стадии дробления.
• Если эмбрионы культивируются до 3-го дня, они должны быть перенесены в свежую уравновешенную Среду дробления (K-SICM) для инкубации в течение ночи.

---

Оценка эмбрионов на 3-й день

Через 66–74 часа после оплодотворения эмбрионы еще раз оцениваются перед переносом, криоконсервацией или последующим культивированием (5–6 день).

 

Поместите чашку на нагревательный столик диссекцион-

ного микроскопа для оценки стадии дробления.

• Используя Flexipet^TM, поворачивайте эмбрионы для всестороннего обзора под максимальным увеличением диссекционного микроскопа. Эмбрионы оцениваются по количеству бластомеров, правильной форме бластомеров, степени цитоплазматической фрагментации и степени дробления. Эмбрионы должны находиться на 6–8-клеточной стадии развития.
• Эмбрионы, отобранные для переноса, переносятся в новую чашку со свежей уравновешенной Средой дробления. Оставшиеся эмбрионы должны быть заморожены с помощью Набора для криоконсервации эмбрионов (K-SICS-5000) на стадии дробления.
• Если эмбрионы культивируются до 5-го дня, они должны быть перенесены в свежую уравновешенную Среду для бластоцист (K-SIВM).

---

Биопсия бластомера

Процедура обычно проводится на 3-й день развития эмбриона, до начала компактизации бластомеров, и проводится рано утром. Один или два бластомера извлекаются для предимплантационной генетической диагностики. Для данной процедуры используется Среда для биопсии бластомера.

 

1. Инкубируйте 5 мкл капли Среды для биопсии бластомеров (K-SIEB) под маслом как минимум 6 часов в CO₂ при37°C.
2. Поместите эмбрионы в Среду для биопсии на время от 1 до 10 мин. (Среда для биопсии на основе бикарбонатно-го буфера и поэтому не должна содержаться вне 6% CO₂ более 10 мин. Кроме того, среда не содержит кальция и магния, и нахождение там эмбрионов нужно минимизировать для снижения негативных эффектов в эмбриональном развитии).
3. Проведите биопсию в Среде для биопсии эмбрионов и затем перенесите эмбрионы в Среду для бластоцист (K-SIBM), предварительно отмыв в новой среде.
4. Отправьте отобранные бластомеры для генетического анализа.
5. Если оставшиеся эмбрионы пригодны для криоконсервации после биопсии бластомера(ов), они должны культивироваться далее до 5-го дня, так как это улучшает их шансы на выживание.

---

Криоконсервация эмбрионов на стадии дробления

Набор для криоконсервации эмбрионов (K-SICS-5000) подходит для замораживания эмбрионов на стадиях от зиготы до морулы. Если требуется замораживание бластоцисты, должет быть использован Набор для криоконсервации бластоцист.

Набор для эмбрионов основан на буфере HEPES и содержит пропандиол и сахарозу в качестве криопротекторов.

Набор состоит из трех растворов.

Раствор 1. Буфер для криоконсервации, не содержит криопротекторов (10 мл).

Раствор 2. Буфер для криоконсервации, содержащий 1.5М пропандиол (10 мл).

Раствор 3. Буфер для криконсервации, содержащий 1.5М пропандиол и 0.1М сахарозу (20 мл).

 

Продолжаются обсуждения, где лучше замораживать – в соломинах или флаконах. Мы рекомендуем соломины, так как они проще в применении, безопасные при заборе материала и хорошо хранят материал. Характеристики охлаждения для флаконов и соломин отличны, и протоколы для замораживания в соломинах, описанные ниже, не подходят для замораживания во флаконах.

 

Отбор эмбрионов

Каждая ЭКО-лаборатория имеет свои собственные критерии для замораживания эмбрионов, но существует правило, что любой эмбрион с фрагментацией менее 30%, находящийся на соответствующей стадии развития, может быть заморожен.

Методика

1. Уравновесьте Раствор 1 в течение 1–10 мин при 37°C на воздухе. Уравновесьте Растворы 2 и 3 при комнатной температуре (~20°C) в течение 10 мин.
2. Поместите отобранные эмбрионы из культуральной среды в нагретый Раствор 1 и инкубируйте 10 мин. при комнатной температуре (~20°C). Это подготовит эмбрионы к постепенному охлаждению.
3. Снабдите соломины необходимой информацией. Не наносите надписи на поверхность самой соломины, растворитель маркера может проникнуть сквозь стенку соломины и повредить эмбрион. Используйте пленку (подобную пленке для автоклавирования) для защиты соломины.
4. Перенесите эмбрионы в Раствор 2 и инкубируйте в течение 10 мин. при комнатной температуре. Включите замораживатель и дождитесь, когда будет достигнута стартовая температура.
5. Поместите эмбрионы в Раствор 3 и немедленно начните заполнять подготовленные соломины. Один эмбрион помещается в одну соломину.
6. Поместите эмбрионы, аспирируя 20 мм столбик буфера в соломину, затем 10 мм воздушного пузырька и затем 30 мм буфера, содержащего эмбрион, затем снова 10 мм воздушного пузырька и снова 20 мм буфера и в конце – воздух. Когда первый столбик буфера коснется ватной пробки, надо прекратить аспирацию, а соломину нужно запечатать (рис. 5).
7. Запечатайте дно соломины пробкой или порошком для пломбировки Seal-easeTM (Becton Dickinson) согласно рекомендациям компании-производителя. Повторите процедуру для всех соломин.
8. Поместите все соломины в замораживатель и запустите программу замораживания.
9. Программа должна приблизительно соответствовать программе, указанной ниже.
   • Стартовая температура 20°C
   • Охладите до -7°C со скоростью 3° в минуту
   • Держите в течение 10 мин.
   • Проведите сиддинг
   • Держите в течение 10 мин.
   • Охлаждайте с -7°C до -30°C со скоростью 0.3° в мин.
   • Охлаждайте с -30°C до -150°C со скоростью 50° в мин.
   • Поместите в жидкий азот и храните

 

 

См. Таблицу ниже

Раствор 1 10 мин.

Раствор 2 10 мин.

Раствор 3 Для заполнения

 

Сиддинг производится касанием охлажденного в жидком азоте ватного тампона или пинцета области раздела воздух–жидкость внутри соломины. Производится для каждой соломины для старта кристаллизации.

---

Размораживание эмбрионов, замороженных на стадии дробления

Пронуклеарные и эмбрионы на стадии дробления размора-

живаются и регидратируются с помощью Набора для размо-

раживания эмбрионов (K-SITS-5000).

Четыре Раствора для размораживания:

Раствор 1. Буфер для криоконсервации с 1М пропандиолом и 0.2М сахарозой.

Раствор 2. Буфер для криоконсервации 0.5М пропандиолом и 0.2М сахарозой.

Раствор 3. Буфер для криоконсервации с 0.2М сахарозой.

Раствор 4. Буфер для криоконсервации без криопротекторов.

 

Эмбрионы должны размораживаться в день переноса или за день до переноса, если хотят культивировать эмбрион в течение ночи, для улучшения потенциала развития эмбриона перед переносом.

 

Методика

1. Уравновесьте четыре раствора в течение 10 мин. при 20°C.
2. Разморозьте соломины на воздухе в течение 40 сек. Затем нагревайте на водной бане (при 30°C) в течение 30 сек.
3. Отломите конец соломины, присоедините шприц, затем отломите другой конец соломины.
4.  Вылейте содержимое соломины в чашку Петри, когда конец соломины будет в поле зрения диссекционного микроскопа.
5. Как только эмбрион будет визуализирован, он должен быть перенесен в Раствор 1 для размораживания.
6. Повторите процедуру для всех размороженных эмбрионов.
7. Эмбрионы должны находиться по 5 мин. в каждом Растворе.
8. После того как эмбрионы будут инкубированы в Растворе 4 в течение 5 мин., поместите чашку на 37°C еще на 5 мин.
9. Перенесите эмбрионы в уравновешенную Среду дробления (K-SICM) и инкубируйте перед переносом.

Раствор 1 5 мин.

Раствор 2 5 мин.

Раствор 3 5 мин.

Раствор 4 5 мин. (комнатная температура)

               5 мин. (37°C)

 

 

Рис.5