Stoik Logo
Главная » Работа со средами » Культивирование бластоцист

Культивирование бластоцист

Группа сред для культивирования эмбриона на стадии бластоцисты.

Культивирование бластоцист

Номера по каталогу:

Среда для бластоцист K-SIBM-20, K-SIBM-50.

Это последняя стадия культивирования со средами Cook, среда, основанная на бикарбонатном буфере для развития бластоцист.


Набор для криоконсервации бластоцист

K-SIBF-5000.

Набор на основе HEPES-буфера с глицерином в качестве криопротектора.

 

Набор для размораживания бластоцист

K-SIBT-5000

Набор на основе HEPES-буфера для размораживания криоконсервированных бластоцист.

 

Набор для витрификации бластоцист

K-SIBV-5000

Набор на основе HEPES для витрификации бластоцист.

 

Набор для размораживания витрифицированных бластоцист

K-SIBW-5000

Набор на основе HEPES для размораживания витрифицированных бластоцист.


Длительное культивирование (c 3-го по 5–6-й день)

  • Эмбрионы должны быть перенесены в уравновешенную среду для бластоцист (K-SIBM) утром 3-го дня культивирования.
  • Эмбрионы должны находиться по крайней мере на 6–8-й клеточной стадии развития. Определенная часть должна быть компактизирована (до 20%).
  • Образование морулы или ранней бластоцисты должно продолжаться весь 4-й день с образованием бластоцеля на 5-й день культивирования.
  • Бластоцисты, содержащие много клеток и хорошо выраженную внутреннюю клеточную массу, могут быть отобраны для переноса.
  • Подсчет соотношения количества клеток из внутренней клеточной массы к клеткам трофоэктодермы, может быть произведен с помощью инвертированной оптики Хоффмана. Соотношение трофоэктодермы к внутренней клеточной массе в соотношении 2:1 дает наибольшую частотуимплантаций.

 

Оценка внутренней клеточной массы

  • Компактизирована, много клеток.
  • Плохо сгруппирована, несколько клеток.
  • Очень мало клеток.

Оценка трофоэктодермы

  • Много клеток, формирующих сплошной эпителий.
  • Некоторое количество клеток, формирующих неплотный эпителий.
  • Очень мало клеток.

 

Бластоцистам присваиваются баллы от 1 до 6 в зависимости от уровня их развития и стадии вылупления бластоцисты:

  1. Ранняя бластоциста; бластоцель занимает меньше половины объема эмбриона.
  2. Бластоциста; бластоцель занимает больше половины объема эмбриона.
  3. Зрелая бластоциста; полностью сформированный бластоцель заполняет внутреннюю часть эмбриона.
  4. Поздняя бластоциста; объем бластоцеля увеличивается, и zona pellucida утоньшается.
  5. Вылупляющаяся бластоциста; трофоэктодерма начинает выпячиваться сквозь zona pellucida.
  6. Вылупившаяся бластоциста; бластоциста полностью вышла из оболочки.

Криоконсервация бластоцист (5-й день)

На 5-й день культивирования требуется заморозить эмбрионы на этой стадии. Эмбрион замораживается с использованием пропандиола и сахарозы до 4-го дня культивирования, но эти криопротекторы не подходят для бластоцисты. Набор для криоконсервации бластоцист Cook – это трехступенчатая система, содержащая буфер для замораживания с глицерином.


Раствор 1. Буфер для криоконсервации.
Раствор 2. Буфер для криоконсервации с 5% глицерина (об.).
Раствор 3. Буфер для криоконсервации с 9% глицерина (об.) и 0.2М сахарозой.

 


Протокол замораживания бластоцист
Методика

  1. Добавьте 0.5 мл Раствор 1 в первую лунку четырехлуночного планшета Nunc® 4 и поместите в термостат на 37°C на воздухе на 10 мин. для достижения комнатной температуры. Нагревайте Растворы 2 и 3 до комнатной температуры (~20°C) в течение 10 мин.
  2. Перенесите бластоцисты из Среды для бластоцист в Раствор 1, инкубируйте на 10 мин. при комнатной температуре (~20°C).
  3. Добавьте 0.5 мл Раствора 2 во вторую лунку планшета Nunc®.
  4. В зависимости от числа замораживаемых бластоцист добавьте до 1 мл Раствора 3 в третью и четвертую лунки.
  5. Перенесите бластоцисты из Раствора 1 в Раствор 2 и инкубируйте 10 мин.
  6. Перенесите бластоцисты в Раствор 3 и немедленно начните заполнять подготовленные соломины для замораживания. Одна бластоциста помещается в одну соломину.
    Раствор 1 - 10 мин.
    Раствор 2 - 10 мин.
    Раствор 3 - 10 мин.
  7. Заполните соломину, аспирируя 20 мм столбик среды, затем 10 мм пузырек воздуха, 30 мм столбик среды с бластоцистой, 10 мм пузырек воздуха, 20 мм среды и затем воздух. Как только среда достигнет заглушки, остановите аспирацию, остановив движение фаз в соломине (см. рис. 6 ниже).
  8. Запечатайте дно соломины пробкой или пломбировочным порошком Seal-easeTM (Becton Dickinson). Поместите соломину в замораживатель. Запаивание соломины не рекомендуется, т.к. соломина может лопнуть и при нагреве материал соломины может выделить эмбриотоксичные вещества.
  9. Запустите программу замораживания после инкубации 10 мин. (с Раствором 3, заполненным внутри соломины).
  10. Программа замораживания должна примерно соответствовать указанным параметрам:
    • Старт при 20°C
    • Охлаждение до -7°C со скоростью 3°C в мин.
    • Держать в течение 10 мин.
    • Провести сиддинг
    • Держать в течение 10 мин.
    • Охлаждение с -7°C до -30°C со скоростью -0.3°C в мин.
    • Охлаждение с -30°C до -150°C со скоростью -50° в мин.
    • Поместить в жидкий азот и хранить в нем.

Сиддинг производится касанием охлажденным в жидком азоте ватным тампоном или пинцетом места раздела жидкость-воздух в соломине для старта кристаллизации.


Протокол размораживания бластоцист

Набор для размораживания бластоцист (K-SIBT-5000), четырехступенчатая система, содержащая буфер для криоконсервации.

 

Флакон 1. Буфер для криоконсервации с 0.5М сахарозой.
Флакон 2. Буфер для криоконсервации с 0.2М сахарозой.
Флакон 3. Буфер для криоконсервации с 0.1М сахарозой.
Флакон 4. Буфер для криоконсервации

 

Методика

  1. Нагрейте все четыре Раствора до ~20°C в течение 10 мин.
  2. Размораживайте соломины на воздухе в течение 40 секунд, а затем на водяной бане (при 30°C) в течение 30 секунд.
  3. Отломите конец соломины, присоедините шприц, затем отломите другой конец соломины.
  4. Как только конец соломины будет в поле зрения в диссекционном микроскопе, удалите все содержимое из соломины в чашку Петри.
  5. Как только бластоциста будет визуализирована, перенесите ее из Буфера для криоконсервации в Раствор 1 для размораживания.
  6. Повторите процедуру для всех размораживаемых бластоцист.
  7. Инкубируйте бластоцисты в Растворе 1 в течение 10 мин.
  8. Перенесите бластоцисты в Раствор 2 на 10 мин.
  9. Перенесите бластоцисты в Раствор 3 на 10 мин.
  10. Перенесите бластоцисты в Раствор 4 на 10 мин.
  11. Поместите бластоцисты на нагревательный столик при 37°C на 10 мин.
  12. Перенесите бластоцисты в уравновешенную Среду для бластоцист (K-SIBM).


Раствор  Время

Раствор 1 10 мин.

Раствор 2 10 мин.
Раствор 3 10 мин.
Раствор 4 10 мин.

Рис 6.

Культивирование бластоцист схема

 


Витрификация бластоцист

Витрификация не требует дорогого оборудования для программируемого замораживания и нуждается только в небольшом объеме буфера для витрификации и охлаждения до очень низкой температуры.
Набор для витрификации бластоцист (K-SIBV-5000), трехступенчатая система, включающая буфер для витрификации с этиленгликолем, DMSO и трегалозой в качестве криопротекторов.

 

Раствор 1. Буфер для витрификации.
Раствор 2. Буфер для витрификации с 8% DMSO (об.) и 8% этиленгликолем (об.).
Раствор 3. Буфер для витрификации с 16% DMSO (об.), 16% этиленгликолем (об.) и 0.68 M трегалозой.
Раствор 4. DMSO.


Протокол витрификации бластоцист
Методика

  1. Нагрейте все четыре Раствора до 37°C.
  2. Откройте флакон с Раствором 4 (DMSO) и добавьте 400 мкл к 4.6 мл Раствора 2 в другой посуде и хорошо перемешайте.
  3. Добавьте 1 мл Раствора 4 (DMSO) к 5.25 мл Раствора 3 в другой посуде и хорошо перемешайте.
  4. Подготовьте Растворы в 4-луночном планшете, добавляя:
    • 800 мкл Раствора 1 в первую и вторую лунки;
    • 800 мкл приготовленного Раствора 2 в третью лунку;
    • 800 мкл приготовленного Раствора 3 в четвертую лунку.
  5. Поместите в первую лунку максимум три бластоцисты.
  6. Переместите бластоцисты во вторую лунку. Подготовьте приспособление для охлаждения.
  7. Установите таймер на три минуты, но не запускайте.
  8. Поместите бластоцисты в третью лунку на две минуты, запустите таймер.
  9. Через две минуты перенесите бластоцисты в четвертую лунку. Сделайте следующую процедуру за 20–30 сек.
  10. Используя точную пипетку со сменным наконечником, отберите 1.5 мкл Раствора с бластоцистой. Избегайте образования пузырей.
  11. Поместите каплю с бластоцистой в охлаждающее приспособление и немедленно витрифицируйте в соответствии с используемым лабораторным методом.

 

Размораживание витрифицированных бластоцист

Набор для размораживания витрифицированных бластоцист (K-SIBW-5000), трехступенчатая система, включающая буфер для витрификации.


Раствор 1. Буфер для витрификации с 0.33 M трегалозой.
Раствор 2. Буфер для витрификации с 0.2 M трегалозой.
Раствор 3. Буфер для витрификации.

 

Протокол размораживания витрифицированных бластоцист
Методика

  1. Нагрейте все три Раствора до 37°C.
  2. Подготовьте подходящий объем Среды для бластоцист (K-SIBM) в инкубаторе в 6% CO2 при 37°C, минимум в течение 4 часов, для культивирования бластоцист после размораживания.
  3. Возьмите необходимые приспособления с витрифицированными бластоцистами и нагревайте в соответствии с инструкцией производителя устройств.
  4. Подготовьте Растворы в 4-луночном планшете, добавляя:
    • 800 мкл Раствора 1 в первую и вторую лунки;
    • 800 мкл приготовленного Раствора 2 в третью лунку;
    • 800 мкл приготовленного Раствора 3 в четвертую лунку.
  5. Немедленно извлеките бластоцисты из приспособления для витрификации и поместите в первую лунку и НЕМЕД-ЛЕННО НАЧНИТЕ ПЕРЕМЕШИВАТЬ до растворения частицы.
  6. Перенесите пипеткой бластоцисты во вторую лунку. Бластоциста сморщится до полностью спавшегося состояния.
  7. Перенесите бластоцисту в третью лунку на 5 мин.
  8. Перенесите бластоцисту в четвертую лунку на 5 мин. Хорошо отмойте бластоцисту.
  9. Поместите бластоцисту в чашку с уравновешенной Средой для бластоцист (K-SIBM) и культивируйте до переноса.


Похожие новости:

COOK logo COOK Medical Ukrainian Representative
Copyright © stoik 2012 All rights reserved
E-mail : stoik.ivf@gmail.com
Телефон : (067) 112-92-92